熒光定量PCR儀驗證

1.什么是熒光定量PCR儀

熒光定量PCR儀是1996 年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新型定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，在PCR進行的同時對其進行實時在線監(jiān)控反應過程，結合配備的檢測器對產(chǎn)物進行分析，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的儀器。所以熒光定量PCR儀產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是在PCR擴增過程中，而非PCR結束之后，進行收集的。目前SYBR Green I染料法和TaqMan探針法是常用的兩種qPCR檢測方法。熒光定量PCR儀廣泛應用于分子生物學研究如核酸定量分析；醫(yī)學研究如病原體檢測、腫瘤基因檢測；食品病原微生物的檢測、轉基因食品檢測等等。目前的病毒核酸檢測絕大多數(shù)都是采用熒光定量PCR方法，對病毒RNA運用逆轉錄后PCR的方式擴增目的序列進行檢測。

2.熒光定量PCR儀的工作原理

將標記有熒光素的探針與模板DNA混合后，完成高溫變性、低溫復性、適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應規(guī)律，與模板DNA互補配對的探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光；隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值，每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），同時利用數(shù)個已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數(shù)。

熒光染料：熒光染料也稱DNA結合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結合，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號，但結合雙鏈DNA后，其熒光信號可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結合量也增大，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。

熒光探針：常用的熒光探針為TaqMan探針，其基本原理是依據(jù)目的基因設計合成一個能夠與之特異性雜交的探針，該探針的5'端標記熒光基團，3'端標記淬滅基團。正常情況下兩個基團的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時，引物與該探針同時結合到模板上，探針的結合位置位于上下游引物之間。當擴增延伸到探針結合的位置時，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。

3.術語解釋

(1) 基線：是指擴增曲線的水平部分。是指在PCR擴增反應的最初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即是基線。

(2) 閾值：是一個熒光強度值，熒光域值必須設定在 PCR擴增的指數(shù)期。

(3) Ct值（閾值循環(huán)）是熒光定量PCR儀擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的熒光閾值時的所對應的擴增循環(huán)數(shù)。

(4) 擴增曲線: 是在實時熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進行PCR反應過程中，通過檢測系統(tǒng)對PCR管內的樣品進行實時檢測，最后將熒光信號值通過成像技術顯現(xiàn)在計算機上。正常的擴增曲線包括四個階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺期。

(5) 熒光強度精密度：均熱塊測量孔在同一熒光條件下熒光強度重復測量值的一致性。

4.怎么做熒光定量PCR儀驗證呢？

熒光定量PCR儀指通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時監(jiān)測反應過程的儀器。結合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行定性和定量分析，計算待測樣品模板的初始濃度。我們都知道進行定性定量分析的儀器的要求都很高，況且熒光定量PCR儀比較敏感，結果比較精確，導致一點錯誤的參數(shù)或者誤差就會出現(xiàn)*相反的數(shù)據(jù)結果。熒光定量PCR檢測儀在移動、使用一段時間后，例如溫度系統(tǒng)引起的誤差；閾值循環(huán)數(shù)示值誤差、均勻度、精密度；通道峰值強度一致性；溶解溫度漂移、溫度比及各個要求的系數(shù)是否改變，能否達到我們需要的要求標準等等，都需要通過檢測來驗證它的各項參數(shù)是否處于正常范圍內、是否符合要求，以防止該儀器在頻繁使用過程沒有對其進行合理的安排而產(chǎn)生誤差，對數(shù)據(jù)結果造成影響。所以熒光定量PCR檢測儀進行定期驗證很重要，這樣既能確保我們的儀器一直處于良好、靈敏的工作狀態(tài)，也能保證我們做出的數(shù)據(jù)結果準確性，降低試驗室的風險。

5. 熒光定量PCR儀驗證的項目如下

a.  溫度示值誤差

b.  溫度均勻度

c.  溫度最大過沖量

d.  平均升溫速率

e.  平均降溫速率

f.  閾值循環(huán)數(shù)示值誤差

g.  閾值循環(huán)數(shù)均勻度

h.  閾值循環(huán)數(shù)精密度

i.  通道峰值強度一致性

j.  線性靈敏系數(shù)

k.  溶解溫度漂移

l.  溶解溫度比

m.  熒光強度精密度

n.  樣本測量精密度

o.  熒光線性相關系數(shù)

p.  樣本線性相關系數(shù)

6. 熒光定量PCR儀操作過程中注意事項

a.  熒光定量PCR屬于精密性試驗，需要專業(yè)人員操作，在操作過程中需要注意各方面細節(jié)實驗以保證實驗的可靠可重復性。

b.  實驗室注意分區(qū)：試劑準備間，樣本處理間，PCR室，電泳間要有明確區(qū)分，各房間實驗室的實驗服不得混用；

c.  試劑準備間及樣本處理間不處理實驗相關的高濃度的核酸模板（如高濃度的標準品，PCR產(chǎn)物等）；

d.  減少頻繁多次的走動，尤其去過電泳間之后當天不可進入其他房間；

e.  使用生物安全柜加樣，不同位置的移液器不可混用，不要隨意更換其位置；

f.  在檢測體系中添加UNG酶系統(tǒng)用于避免PCR產(chǎn)物的污染。

g.  條件允許，盡量使用一次性帶濾芯移液槍吸頭，使用非帶濾芯的吸頭的時候，移液器盡量不要使用最大量程移液，移液器盡量避免使用第二檔，防止打出氣泡，回彈污染移液器。

h.  加樣后將熒光定量PCR管瞬時離心，不要在熒光定量PCR管上做任何標志，不能用手碰到PCR管蓋上的采光部位，以免影響實驗的準確性。

i.  熒光探針應避光保存，加入核酸模板后應盡快上機，以防探針淬滅。

7.對與熒光定量PCR儀問題解答

(1)為什么熒光定量PCR的擴增產(chǎn)物片段長度應該控制在80-300bp范圍內？

答：每個基因序列長短不一，有的好幾kb，有的幾百bp，但是我們在設計引物的時候只需要要求產(chǎn)物長度80-300bp，太短或者太長都不適合做熒光定量PCR檢測。產(chǎn)物片段太短，無法跟引物二聚體區(qū)分，引物二聚體的長度大概在30-40bp，小于80bp很難區(qū)分是引物二聚體還是產(chǎn)物。產(chǎn)物片段太長，超過300bp，容易致使擴增效率低下，不能有效的檢測出該基因的量。打個比方，我們統(tǒng)計某個試驗室有多少個人，只需要數(shù)一下有幾張嘴就可以了，在檢測基因的時候也是一樣的，只需要檢測某個基因的某一段序列來代表整個序列即可。如果既要數(shù)多少張嘴也要數(shù)多少個鼻子、耳朵等反而容易數(shù)錯。

(2)引物設計最佳長度是多少？

答：一般來說，引物長度大概在20-24bp范圍是比較好的。當然我們在設計引物的時候一定要注意引物的TM值，因為這個關系到最佳退火溫度。經(jīng)過大量的實驗證明，60℃是一個比較好的TM值。退火溫度太低容易導致非特異性擴增，退火溫度太高一般會導致擴增效率比較低，擴增曲線起峰比較晚，CT值延后。

(3)采集樣本量的多少會不會影響實驗結果？答：不會。

(4)反轉錄酶效率高低會不會影響實驗結果？

答：不會。這取決于各公司對于反轉錄試劑盒的優(yōu)化能力。

(5)Taq酶的效率會不會影響實驗結果？

答：Taq酶的效率影響比較大，一般要求用熱啟動Taq酶，且效率要比較高才行，商品化的熒光定量試劑盒，每個廠家都會在自己的產(chǎn)品的基礎上，把效率優(yōu)化到好的狀態(tài)，接近于100%，效率太低實驗結果不可用。

(6)熒光染料的多少會不會影響實驗結果？

答：當然是有影響的。熒光染料過于飽和，會導致某些儀器出現(xiàn)噪點干擾；熒光染料不飽和，熒光值太低，導致提前進入平臺期，擴增曲線平緩。在熒光定量實驗中主要看CT值，因此后期擴增曲線進入平臺期顯得不那么重要，只是圖形不夠美觀罷了，如果二者必選其一的話，寧愿選擇熒光染料略微不飽和。在使用同一公司的同一款產(chǎn)品時，該影響基本可以忽略。

(7)操作過程中的誤差會不會影響？

答：操作過程有一定的影響，主要體現(xiàn)在均一性上。均一性是指體系內的所有組分均勻的混合在一起，瞬時離心可以解決均一性問題。對于新手來說，最好調整PCR體系在20ul以上，過小的體系更容易產(chǎn)生誤差。如果退火溫度優(yōu)化得合適，引物濃度對CT的影響會降到zui低。所以有的操作誤差（比如引物濃度）是可以通過優(yōu)化退火溫度來避免的。

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